La cabina de seguridad biológica debe ser de uso exclusivo para el marcaje celular, y situarse preferentemente en una sala aparte del resto de áreas de la unidad de radiofarmacia.

La orden ministerial especifica que esta cabina debe proporcionar un grado A en el ambiente de trabajo y ser, como mínimo, clase II tipo B1, ubicada en un entorno grado B o grado C si la administración es inmediata. Puede emplearse un aislador de grado A con entorno mínimo de grado D.

En el caso de que la cabina esté situada en la misma sala donde se preparan otros radiofármacos, debe evaluarse y documentarse mediante un análisis de riesgos la compatibilidad de ambas actividades. En caso de incompatibilidad, debe existir una separación temporal de las actividades realizadas en la misma sala.

La mayoría de las cabinas de seguridad biológica instaladas en las unidades de radiofarmacia, cumplen la norma europea de clase II EN 12469, que esboza un único diseño que corresponde funcionalmente al subtipo A2 de la norma estadounidense NSF (National Sanitary Foundation).

En los procedimientos de marcaje celular se manipulan soluciones acuosas en recipientes cerrados y no se emplean reactivos volátiles ni se realizan calentamientos. Por lo que la clase II EN 12469 ofrece la misma protección del producto, operador y ambiente que otras subclases, con alta estabilidad de flujo unidireccional y sin dependencia crítica del sistema de extracción del edificio.

Dado que la extracción parcial del aire propia de las cabinas B1 solo aporta ventajas cuando se manipulan sustancias volátiles, y, considerando que en el marcaje celular con radioisótopos no existe volatilidad, como profesionales especialistas en radiofarmacia avalamos que se puedan utilizar cabinas tipo IIA, basándonos en un análisis de riesgos que garantice la protección radiológica y microbiológica requerida.

La centrífuga utilizada para la separación celular debe asegurar la contención en caso de derrame o rotura, utilizando cubetas cerradas o bien protocolos de limpieza exhaustivos, que deberían realizarse antes y después de cada preparación.

Es importante conocer la relación entre la fuerza centrífuga relativa (g) y las revoluciones por minuto (RPM) de la centrífuga que se va a utilizar, ya que las RPM dependen directamente del radio del rotor. La conversión entre g y RPM viene dada por la ecuación:

El activímetro (calibrador de dosis) es un instrumento necesario para medir la actividad radiactiva. En el marcaje celular se utiliza para medir la radiactividad unida a las células, la presente en el sobrenadante (no unida a las células), y la correspondiente a la de la actividad radiactiva final del radiofármaco.

El microscopio óptico es necesario para la realización del ensayo de viabilidad celular.

Equipo empleado para la realización del control de calidad de la [99mTc]Tc-exametazima mediante cromatografía en capa fina.

Para obtener un rendimiento óptimo del marcaje y un número adecuado de leucocitos radiomarcados que garantice una buena calidad de imagen, la muestra sanguínea extraída del paciente debe contener al menos 2 × 108 leucocitos3,4. Esto se consigue con un mínimo de 30 ml en pacientes con concentración igual o superior a 5.000 leucocitos/mm311.

Es recomendable conocer el recuento leucocitario del paciente con el fin de extraer mayor volumen de sangre cuando exista neutropenia (<2 × 103 neutrófilos/mm3)3,4,11.

En el momento de la extracción no es necesario que el paciente esté en ayunas; sin embargo, debe considerarse la posible interacción en el marcaje cuando los niveles de colesterol y glucosa son altos5. Para estudios abdominales (como enfermedad inflamatoria intestinal), se requiere ayuno12.

El anticoagulante de elección es el ACD-A (Ph. Eur 01/2020:0209, que consiste en 0,73 g de ácido cítrico anhidro, 2,2 g de citrato sódico dihidrato, 2,45 g de glucosa monohidrato en 100 ml de agua para inyección). Este anticoagulante previene la agregación leucocitaria y la adherencia a las superficies plásticas, lo que resulta en un aumento de la recuperación de leucocitos. Además, el citrato de su composición inhibe la degranulación de los leucocitos y el estrés oxidativo. La proporción recomendada es de 1 ml de ACD-A por cada 6–7,5 ml de sangre5,11.

Como alternativa, se puede utilizar heparina sin conservador a razón de 10 UI/ml de sangre. La heparina incrementa la velocidad de sedimentación globular5,11.

En población pediátrica, el volumen de sangre a extraer debe ajustarse al peso, estado clínico y al volumen sanguíneo total, siguiendo las guías de riesgo mínimo que recomiendan no superar el 2,5% del volumen sanguíneo total en una extracción13. En la práctica, los procedimientos de marcaje leucocitario con [99mTc]Tc-exametazima suelen requerir un volumen mínimo de 10 y 15 ml, dependiendo del recuento celular del paciente14.

Las agujas utilizadas en la extracción deben ser de un calibre de diámetro de al menos 20 G con el fin de minimizar el daño leucocitario3,4.

La sangre se extrae en una o varias jeringas que contengan la proporción adecuada de anticoagulante. La extracción debe realizarse de forma lenta y suave, evitando la formación de espuma3,4.

Una vez obtenida, la muestra se mezcla suavemente invirtiendo la jeringa varias veces, a fin de garantizar su adecuada homogeneización con el anticoagulante3,4.

Para la obtención de plasma libre de células (PLC), conviene extraer una muestra adicional de sangre anticoagulada, empleando la misma proporción de 1 ml de ACD-A por cada 6–7,5 ml de sangre, por ejemplo 15 ml con 2 ml de ACD-A. Este PLC se utiliza como medio durante el proceso de marcaje y en la resuspensión final de los leucocitos3,4,11.

Se obtiene mediante centrifugación durante 10 min a 2.000 g, seguida de la separación del sobrenadante (PLC) respecto al botón celular.

De forma alternativa, puede utilizarse tampón fosfato salino (PBS) a pH 7,4 o solución salina fisiológica3,4.

El mecanismo de marcaje de leucocitos se basa en la difusión pasiva de quelatos lipofílicos y neutros que contienen el isótopo radiactivo.

El [111In]In-oxina es un complejo 3:1 de la oxina (8-hidroxiquinoleina) y el indio-111, generando un compuesto neutro y altamente lipofílico que atraviesa la membrana celular (fig. 4). Una vez en el interior, el complejo se disocia y el indio se une a las proteínas intracitoplasmáticas (fig. 6)4,11.

Figura 4.

Estructura química de la [111In]In-oxina. Es un complejo formado por 3 moléculas de oxina (8-hidroxiquinoleina) y un átomo de 111In.

Fuente: PubChem Compound Database, 119117. Disponible en: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Indium-In-111-Oxyquinoline.

La [99mTc]Tc-exametazima o [99mTc]Tc-d,l-HMPAO (hexametilpropilenaminoxima) (fig. 5) es también un complejo neutro que, en su forma lipofílica, difunde al interior de los leucocitos. Se ha sugerido que, vía el glutatión intracelular y el mayor pH del citoplasma, se convierte en su forma hidrofílica, quedando así atrapado intracelularmente (fig. 4)5,20.

Figura 5.

Estructura química de la exametazima de [99mTc].

Autor: X, Wikipedia, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tc-99m_exametazime_skeletal.svg.

Figura 6.

Esquema del mecanismo de difusión pasiva para el marcaje de los leucocitos.

Fuente: Elaboración propia de los autores.

Debido a su inestabilidad en solución acuosa, la [99mTc]Tc-exametazima debe prepararse inmediatamente antes de su uso. No deben emplearse agentes estabilizadores como el cloruro de cobalto3,5. Previamente, se realizará el control de calidad del radiofármaco de acuerdo con la ficha técnica del fabricante21,22 u otro procedimiento validado.

Para el marcaje del botón leucocitario con [99mTc]Tc-exametazima, se añade una actividad inferior a 740 MBq (20 mCi), en un volumen de 0,5–1 ml. Los volúmenes pequeños mejoran el rendimiento de marcaje23.

Se recomienda efectuar el marcaje en un medio constituido al 50% por plasma11. Si el botón leucocitario se ha resuspendido en 0,5 ml de PLC, se añadirán 0,5 ml de [99mTc]Tc-exametazima, mezclando suavemente.

Se incuba durante 10 min a temperatura ambiente (o 5 min si la resuspensión se ha realizado en suero salino fisiológico).

Aunque la incubación en estufa a la temperatura fisiológica de 37 °C durante 15–20 min puede aumentar el rendimiento de marcaje, las guías de referencia no recomiendan su uso3–5.

Durante la incubación, es conveniente agitar suavemente la suspensión de manera periódica para prevenir la sedimentación celular3,4.

Para la eliminación de la actividad libre del radiofármaco no unida a las células, después de la incubación se añaden al menos 3 ml de PLC (preferentemente hasta 10 ml) y se centrifuga a 150 g durante 5 min3,4.

Como alternativa, puede emplearse plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido durante la separación del botón leucocitario y centrifugado 10 min a 2.000 g3. La utilización del PRP sin centrifugar es una práctica habitual y no se ha evidenciado afectación en el marcaje celular.

Para el marcaje de los leucocitos con [111In]In-oxina, se añaden aproximadamente 20 MBq (540 μCi) al botón leucocitario4.

La presentación comercial disponible de [111In]In-oxina24 consta de 2 viales, uno que contiene 37 MBq (1 mCi) del precursor y otro con tampón Tris. Deben añadirse 0,4 ml de tampón por cada ml de precursor, inmediatamente antes de su incorporación al botón leucocitario, para evitar la adsorción del complejo al vial o a la jeringa.

El tiempo necesario de incubación es de 10–15 min a temperatura ambiente.

Para la fase de lavado, se añaden al menos 3 ml de PBS o de solución salina fisiológica (preferentemente hasta 10 ml) y se centrifuga a 150 g durante 5 min.

Tras la centrifugación, se elimina el sobrenadante, que contiene la actividad no ligada a las células, y se reserva para el cálculo del rendimiento de marcaje.

Una vez completada la centrifugación, se separa el sobrenadante que contiene el radiofármaco no unido y se resuspende el botón leucocitario en 3–5 ml de PLC3–5,11. La extracción se realiza con cánulas o agujas de material plástico de un calibre mínimo de 19 G.

Los leucocitos marcados deben administrarse lo antes posible. La estabilidad del preparado se limita a un máximo de 1 h tras la finalización del marcaje3,4. Después de ese tiempo, la viabilidad y funcionalidad de los leucocitos disminuyen progresivamente, lo que puede reducir la migración y la capacidad de respuesta inflamatoria, afectando la sensibilidad y la especificidad del estudio. Adicionalmente, se produce elución del radioisótopo desde los leucocitos, de manera más pronunciada en los leucocitos marcados con [99mTc]Tc-exametazima, siendo de hasta un 10% en la primera hora3,4.

Se debe administrar lentamente, preferentemente con agujas de un calibre mínimo de 22G para minimizar el daño celular por estrés3,4.

La actividad de leucocitos marcados con [99mTc]Tc-exametazima oscila entre 185 y 370 MBq (5 y 10 mCi)3. En población pediátrica, la actividad se calcula según las recomendaciones de la EANM, multiplicando la actividad basal (35 MBq) por un factor dependiente del peso corporal25.

Para los leucocitos marcados con [111In]In-oxina, la actividad habitual es de 10–18,5 MBq (0,27–0,50 mCi)4. Debido al mayor impacto dosimétrico, especialmente a nivel esplénico26, su empleo se restringe en población pediátrica en favor de alternativas con menor dosimetría, como los leucocitos marcados con [99mTc]Tc-exametazima.

Para el [99mTc]Tc-exametazima se determina la pureza radioquímica mediante cromatografía en capa fina (radio-TLC) según la ficha técnica del fabricante21,22 o un procedimiento validado. Este control debe completarse antes de añadirlo al botón leucocitario.

Para la [111In]In-oxina comprobar la reconstitución con tampón en la proporción indicada por el fabricante24.

Rutinario para cada preparación:

Rendimiento del marcaje

Se define como el porcentaje de actividad unida a los leucocitos respecto de la actividad total. El procedimiento consiste en medir en el activímetro la actividad del botón leucocitario y la actividad del sobrenadante (actividad no unida a las células).

El rango esperado para los leucocitos marcados con [99mTc]Tc-exametazima es un rendimiento de marcaje entre el 40 y el 80%3 (entre 50 y 80% en el marcaje con [111In]In-oxina)4. Si es inferior al 40%3 (50% con [111In]In-oxina)4, realizar la prueba de viabilidad con azul de tripano y valorar repetir la preparación en función de los hallazgos y de la indicación clínica.

Viabilidad celular (prueba de exclusión con azul de tripano). Se fundamenta en que las células que mantienen la membrana citoplasmática íntegra y, por tanto, la viabilidad, excluyen el colorante y no se tiñen. Sin embargo, las células no viables se observan de color azul al microscopio óptico. La técnica consiste en mezclar 25 μl de azul de tripano (0,4% en agua) con 25 μl de una suspensión de leucocitos marcados. Posteriormente, se deposita una gota de la mezcla en un hemocitómetro y se observa al microscopio óptico. Un porcentaje de células teñidas superior al 4% contraindica su administración al paciente3,4.

Funcionalismo celular: quimiotaxis u otros ensayos específicos, según protocolo de la unidad, para confirmar que el marcaje no altera de forma significativa la función leucocitaria.

Recuperación celular: se define como la fracción de leucocitos viables obtenidos tras el proceso de marcaje isotópico, en relación con la población leucocitaria inicial de la muestra de sangre. La evaluación se realiza mediante el recuento de los distintos subtipos celulares presentes en la muestra final y tras cada etapa de centrifugación. Asimismo, se determina la contaminación residual por eritrocitos y plaquetas. Se consideran aceptables una relación eritrocitos/leucocitos <3 y una relación plaquetas/leucocitos <13,4.

Prueba de simulación de proceso aséptico (media fill) para la verificación del control microbiológico del procedimiento27.

En los pulmones, una captación transitoria temprana es considerada normal. La persistencia después de 30 min sugiere alteración celular durante el procedimiento de marcaje.

Captaciones focales pulmonares orientan a agregados celulares.

La actividad esplénica ha de ser mayor que la hepática. Una captación en hígado igual o mayor que la esplénica sugiere daño celular.