Aunque se ha utilizado por vía oral, la variabilidad en su absorción y el riesgo de que se produzcan vómitos, ha impulsado la utilización intravenosa de busulfán. En el presente trabajo se estudiará la estabilidad de 60mg de busulfán, en volúmenes fijos de 250ml (0,24mg/ml) y 500ml (0,12mg/ml) de suero fisiológico y diferentes condiciones de conservación, en un nuevo envase de plástico, de lámina construida de poliolefina/poliamida.
Material y métodosSe empleó la cromatografía líquida de alta eficacia con detección ultravioleta para determinar las concentraciones de busulfán derivatizado con dietilditiocarbamatotrihidrato sódico. La estabilidad se evaluó, para ambas concentraciones, tanto en nevera como a temperatura ambiente, mediante el t90 de cada ensayo.
ResultadosEl porcentaje de concentración remanente de busulfán a las 24 h siempre fue inferior al 90%. A 25°C y concentración de 0,24mg/ml el t90 fue de 8,4 h; a 4°C y concentración de 0,24mg/ml fue de 16,7 h; a 25°C y concentración de 0,12mg/ml fue de 12 h, y a 4°C y concentración de 0,12mg/ml fue de 11,5 h.
ConclusionesEl presente estudio demuestra que el busulfán a una concentración de 0,24mg/ml en suero fisiológico será estable en las bolsas ensayadas durante un período de almacenamiento de 12 h en nevera más las 2 h de administración del fármaco.
Although it has been used orally, the variability in its absorption and the risk of causing vomiting has lead to a push towards the intravenous use of bulsulfan. This study looks at the stability of 60mg of busulfan, in fixed volumes of 250mL (0.24mg/mL) and 500mL (0.12mg/mL) of serum and different conservation conditions, in a new plastic pack made from polyolefin/polyamide laminates.
Material and methodsHigh-efficiency liquid chromatography with ultraviolet detection was used to determine the concentration of busulfan derivate with sodium diethyldithiocarbamatetrihydrate. Stability was assessed for both concentrations; refrigerated and at room temperature, using the t90 of each sample.
ResultsThe percentage of the remaining busulfan concentration at 24 h was always less than 90%. At 25°C and 0.24mg/mL concentration, the t90 was 8.4 h; at 4°C and a concentration of 0.24mg/mL it was 16.7 h; at 25°C and a concentration of 0.12mg/mL it was 12 h and at 4°C and a concentration of 0.12mg/mL it was 11.5 h.
ConclusionsThis study show that busulfan in a concentration of 0.24mg/mL in serum is stable in the bags tested during a refrigerated storage period of 12 h plus two additional hours of administration of the drug.
El busulfán es un polvo blanco o casi blanco, muy poco soluble en agua1. Se comporta como un agente electrofílico que actúa específicamente durante la fase S del ciclo celular. Reacciona con átomos nucleofílicos de las bases nucleicas formando puentes inter e intracatenarios en la doble hélice de ADN, que provocan interferencias en los procesos de transcripción y replicación del ADN2.
En España las indicaciones del busulfán, según su ficha técnica3,4, varían en función de si se administra por vía oral o intravenosa. Las indicaciones por vía oral son: tratamiento paliativo de la fase crónica de la leucemia granulocítica crónica; remisión prolongada en policitemia vera, especialmente en caso de trombocitosis marcada y determinados casos de trombocitemia esencial, y mielofibrosis. Las indicaciones por vía intravenosa son: seguido de ciclofosfamida, en el tratamiento de acondicionamiento previo al trasplante de células progenitoras hematopoyéticas en pacientes adultos, cuando se considera que la combinación es la opción más viable, y seguido de ciclofosfamida o melfalán, en el tratamiento de acondicionamiento previo al trasplante de células progenitoras hematopoyéticas en pacientes pediátricos.
Aunque el busulfán comenzó a utilizarse de forma oral a dosis altas, junto con ciclofosfamida, como esquema de preparación para el trasplante de médula ósea, la ausencia de una presentación adecuada, la variabilidad de absorción y el riesgo de que se produzcan vómitos, impulsa su utilización intravenosa. La pauta habitualmente utilizada de busulfán es de 0,8 mg/kg/6 h durante 4 días por vía intravenosa5.
En las distintas farmacopeas consultadas, sólo hay una estabilidad sobre el busulfán comprimidos con límites entre el 93,0 y el 107,0%, valores que se suelen emplear en comprimidos cuyas sustancias activas presentan buenas características de estabilidad. La ausencia de especificación en estas farmacopeas nos permite utilizar la especificación general para preparados inyectables con límites comprendidos entre el 90,0 y el 110,0%, límites que se recogen en las farmacopeas para distintos inyectables como brompheniramina o bumetamina inyectables6. Además, este límite se utiliza en preparaciones de busulfán inyectables que se recoge en trabajos previos3,7.
En España la forma intravenosa de busulfán (Busilvex®) se presenta en ampollas de una concentración de 6 mg/ml de busulfán en una mezcla de N,N-dimetilacetamida y polietilenglicol3. Según las instrucciones del fabricante, para la administración intravenosa, las ampollas de Busilvex® se deben diluir en suero fisiológico o glucosa al 5% hasta obtener una concentración de 0,5 mg/ml. Su estabilidad a temperatura ambiente (25 °C) es de 8 h3,7, mientras que conservado en refrigeración (2-8 °C) la mezcla es estable hasta 12 h3,7.
En el presente trabajo se estudiará la estabilidad de una dosis estándar de 60 mg (10 ml) de busulfán en volúmenes fijos de 250 y 500 ml de suero fisiológico, obtenido mediante dilución de un preparado comercial sometido a diferentes condiciones de conservación, en un nuevo envase de plástico de lámina coextruida de poliolefina/poliamida.
MATERIAL Y MÉTODOSMaterialPara la validación del método cromatográfico y la preparación de las rectas de calibración se empleó busulfán Sigma® como patrón; como agente derivatizante se utilizó el dietilditiocarbamatotrihidrato sódico (DDCT) Sigma®. Se empleó acetonitrilo Sigma-Aldrich® para preparar la disolución de busulfán previa a la preparación de la solución madre para las calibraciones. Otros reactivos empleados en la preparación de la fase móvil fueron: agua bidestilada Fresenius® y Metanol Merk®, de grado analítico.
La preparación de las mezclas intravenosas de busulfán se realizó empleando bolsas de cloruro sódico al 0,9% Viaflo Baxter® de 500 y 250 ml.
Técnica analíticaLa técnica utilizada para la determinación del busulfán fue la cromatografía líquida de alta eficacia (CLAE). El equipo cromatográfico incorporaba un inyector automático Spectra System AS1000, un detector de absorción ultravioleta Waters 484, una bomba Waters 515 y un integrador Penelson NCI900 conectado a un ordenador.
Como fase estacionaria se empleó una columna Kromasil® C18 con un tamaño de partícula de 5 μm y unas dimensiones de 150 × 4,6 mm. Como fase móvil se utilizó una solución compuesta por metanol y agua en proporción 80:20. La fase móvil se preparó mediante filtración en vacío a través de una membrana de 0,45 μm de poro Millipore®.
El flujo de elución fue de 1,5 ml/min. La detección se realizó a una longitud de onda a 251 nm.
Se preparó una disolución estándar madre de busulfán de 25 μg/ml en suero fisiológico. Para ello se pesaron 1,25 mg de busulfán y se disolvieron en 50 ml de acetonitrilo para garantizar su completa disolución. A continuación se diluyó esta mezcla con 950 ml de suero fisiológico. A partir de esta solución madre se prepararon las diluciones patrón en suero fisiológico (25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 y 0,78 μg/ml). A 500 μl de cada calibrador se le añadió 125 μl de la solución derivatizante (DDCT en agua bidestilada a una concentración de 82 mg/ml8). Las mezclas derivatizadas se agitan en Vortex® (Reax 1000) durante un periodo de 30 segundos a temperatura ambiente. Se inyectaron 200 μL de mezcla derivatizada en el sistema cromatográfico mediante un inyector automático. Este proceso se repitió 3 veces para cada dilución patrón.
La exactitud de cada calibrador se determinó a través del error relativo (Evi)9, calculado como el cociente entre el error absoluto (Eai)×100, expresado como la diferencia entre el valor experimental (Vei) y el valor interpolado en la recta de calibración (Vii), y el Vii(Evi=[Vei−Vii]×100/Vii). En cuanto a la precisión, la bibliografía consultada propone la obtención de los coeficientes de variación (CVi)10 calculados como el cociente entre la desviación estándar (DEi) × 100 y la media de las 3 muestras analizadas de cada calibrador(Xi): (SDi × 100)/×i. La linealidad del modelo se caracteriza por el coeficiente de determinación (r2).
La validación del método analítico se llevó a cabo tanto intradía como interdía, con el fin de asegurar que en todo momento se estaba dentro de los límites recomendados de exactitud y precisión9.
Estudio de la estabilidad químicaEl estudio presentado simula las condiciones reales de preparación de la mezcla intravenosa, por lo que se admite como volumen inicial del fluido intravenoso y cantidad de medicamento en el envase, los declarados por el fabricante. Así, la mezcla intravenosa se preparó a partir de viales de busulfán (Busilvex® 60 mg/10 ml, Laboratorio Pierre Fabre Iberica), añadiendo 10 ml de la preparación a la bolsa de suero fisiológico previa extracción de 10 ml de la bolsa. Se emplearon bolsas de 250 y 500 ml de poliolefinas (Viaflo®) conservadas a temperatura ambiente (25 °C) y en nevera (4 °C). Las concentraciones teóricas finales de las mezclas intravenosas de busulfán fueron de 0,24 y 0,12 mg/ml, respectivamente.
Se tomaron muestras de 1 ml de cada una de las bolsas a 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 h. Tras su obtención estas muestras se diluyeron con suero fisiológico (1:40) y congelaron a −40 °C hasta su análisis. Una vez descongeladas se procesaron por triplicado, como se ha descrito para las diluciones patrón.
Se estableció que el proceso de degradación del busulfán corresponde a una cinética de orden 1. De forma que para establecer la estabilidad se determinó el mediante regresión semilogarítmica del porcentaje de concentración remanente de busulfán frente al tiempo. Siguiendo las recomendaciones de las diferentes agencias internacionales11,12, se determinó el de cada ensayo como el límite inferior del intervalo de confianza (IC) del 95%, de forma que puede afirmarse que a tiempo tw la concentración remanente de busulfán es > 90%. Este cálculo lo efectúa el programa informático Sigma Plot®.
RESULTADOSTécnica analíticaEn la figura 1 se muestran los cromatogramas pertenecientes a la concentración más elevada (25 μg/ml), la más baja (0,78 μg/ml) y la muestra sin busulfán (blanco) de la recta de calibración. El tiempo de retención del producto resultante del proceso de derivatización es de 8,5 min. En la figura 1 se aprecia que no hay interferencias para el tiempo de retención del busulfán.
La linealidad se determina a partir de la relación entre las concentraciones y las áreas del cromatograma del modelo y se caracteriza por una recta de regresión de ordenada en el origen −82.938 (IC del 95%, −112.456 a −53.419) y pendiente 141.618.772 (IC del 95%, 193.113.724-144.123.821) y cuyo coeficiente de determinación fue > 0,999 en el ámbito de las concentraciones ensayadas. El error relativo y el CV fueron inferiores al 10%.
La sensibilidad del método fue de 0,635 μg/ml, el límite de detección de 1,836 μg/ml y el límite de cuantificación de 6,119 μg/ml.
Estabilidad químicaEn la tabla 1 se muestran los porcentajes medios de busulfán remanentes en las mezclas intravenosas conservadas a temperatura ambiente y en nevera a distintos tiempos de muestreo. En todas las condiciones ensayadas, el porcentaje de concentración remanente de busulfán a las 24 h fue < 90%.
Porcentajes medios remanentes (%) de las mezclas intravenosas de busulfán conservadas a temperatura ambiente y en nevera a distintos tiempos de muestreo (n = 3)
| Tiempo (h) | Busulfán (0,24 mg/ml) | Busulfán (0,12 mg/ml) | ||||||
| 25 °C | 4 °C | 25 °C | 4 °C | |||||
| Media (%) | DE (%) | Media (%) | DE (%) | Media (%) | DE (%) | Media (%) | DE (%) | |
| 1 | 100,4 | 0,078 | 100 | 2,131 | 100 | 2,761 | 100 | 1,27 |
| 2 | 99,1 | 2,768 | 99,1 | 0,365 | 101,7 | 1,913 | 98,3 | 0 |
| 4 | 97,8 | 0,908 | 98,3 | 2,141 | 97,4 | 2,061 | 94,1 | 4,565 |
| 6 | 93,6 | 0,55 | 94,1 | 2,453 | 98,2 | 3,268 | 95 | 5,726 |
| 8 | 89,8 | 1,139 | 94,5 | 0,801 | 93,1 | 0,217 | 97,5 | 4,557 |
| 10 | 87,7 | 3,338 | 94,1 | 0,766 | 93,1 | 3,463 | 89,1 | 5,97 |
| 12 | 85,2 | 1,89 | 95,3 | 1,794 | 90,5 | 2,215 | 90,8 | 9,32 |
| 24 | 75,5 | 3,643 | 88,2 | 2,173 | 80,3 | 2,054 | 85 | 1,155 |
DE: desviación estándar.
En la figura 2 se muestran las curvas de degradación del busulfán a las distintas temperaturas y condiciones de conservación, así como sus parámetros de regresión y su t90. A 25 °C y concentración de 0,24 mg/ml el t90 fue de 8,4 h; a 4 °C y concentración de 0,24 mg/ml fue de 16,7 h; a 25 °C y concentración de 0,12 mg/ml fue de 12 h, y a 4 °C y 0,12 mg/ml fue de 11,5 h.
Recta de regresión e intervalo de confianza (IC) del logaritmo neperiano (Ln) del porcentaje remanente de busulfán frente al tiempo, para diferentes concentraciones y condiciones de conservación. A) t90 25 °C 0,24 mg/ml; B) t90 4 °C 0,24 mg/ml; C) t90 25 °C 0,12 mg/ml; D) t90 25 °C 0,12 mg/ml.
La técnica analítica utilizada para la determinación de busulfán permite separar adecuadamente el pico del producto resultante del proceso de derivatización de las impurezas de la muestra y presenta una adecuada estabilidad, exactitud y precisión.
En el presente estudio se ha determinado la estabilidad del busulfán en mezclas intravenosas en bolsas de poliolefinas a 2 concentraciones, 0,24 y 0,12 mg/ml, almacenadas en nevera y a temperatura ambiente.
Las concentraciones remanentes de busulfán fueron, durante las 24 h del estudio, superiores a los límites de cuantificación de la técnica analítica asegurando así la validez de las concentraciones obtenidas.
Las bolsas de concentración de 0,24 y 0,12 mg/ml conservadas a temperatura ambiente durante 24 h pierden un 10% de su concentración (t90) a las 8,4 y 12,3 h, respectivamente; valores que coinciden con lo publicado en la bibliografía con relación a la estabilidad del busulfán3,7. Por otra parte, las bolsas conservadas en nevera a 4 °C, durante 24 h, pierden un 10% de su concentración (t90) a las 16,7 h la de 0,24 mg/ml, y 11,5 h la de 0,12 mg/ml.
Estos datos obtenidos concuerdan con las instrucciones del fabricante en la ficha técnica3 y tratados de estabilidad de prestigio7. Sin embargo, parecen alejarse de los presentados en el artículo publicado por Karstens y Kramer13, donde se defiende una estabilidad mucho mayor, de hasta 48 h, en soluciones de 0,5 mg/ml en suero fisiológico conservadas a 13-15 °C. No obstante, debe señalarse que en este trabajo se calcula el t90 interpolando directamente en la recta de regresión y no en la recta que marca el límite inferior del IC del 95%. Esta misma limitación se aprecia en el artículo publicado por Gaisford et al14, que obtiene una estabilidad para una ampolla de busulfán diluida en 50 ml de fisiológico de 27 h entre 24 y 6 °C más 3 h a 25 °C.
En resumen, el presente estudio demuestra que el busulfán a una concentración de 0,24 mg/ml en suero fisiológico será estable en las bolsas ensayadas durante un período de almacenamiento de 12 h en nevera más las 2 h de administración del fármaco.
