El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muerte por tumores en el mundo desarrollado, con más de 608.700 muertes estimadas en el 20081. En España hubo un total de 13.433 fallecidos en ese mismo año, lo cual representa un 14% de todas las muertes por cáncer2. Una parte importante de los pacientes de CCR son tratados con quimioterapia, bien de forma adyuvante tras cirugía, para evitar recidivas de la enfermedad, o bien en presencia del tumor. La quimioterapia aplicada en el CCR es muy variada y puede dar lugar a múltiples combinaciones de fármacos3. Entre ellos tenemos las fluoropirimidinas como base del tratamiento, entre las que se encuentra el 5-fluorouracilo (5-FU), o su profármaco capecitabina, que se suelen administrar en combinación con oxaliplatino (FOLFOX, XELOX, respectivamente) o con irinotecan (FOLFIRI, XELIRI, respectivamente)4. Además en casos de enfermedad metastásica estas combinaciones suelen ir acompañadas de un anticuerpo monoclonal como cetuximab, panitumumab o bevacizumab. Sin embargo, y a pesar de la mejora en la efectividad de estos tratamientos, cerca del 50% de los pacientes a los que se administra la quimioterapia en estadio avanzado no responden a la misma. Otro problema importante es la toxicidad provocada por estos fármacos, que puede conducir a desestimar líneas de tratamiento reduciendo las posibilidades de curación, o a provocar disminuciones y/o retrasos de dosis que hacen peligrar la eficacia5. Además, las reacciones adversas afectan a la calidad de vida de los pacientes y tienen también importantes repercusiones económicas. Las reacciones adversas a medicamentos son la 4a causa de muerte en EEUU. Un análisis con 1.219 pacientes con CCR que recibieron 5-FU, mostró que aproximadamente el 31-34% tuvo toxicidad grado 3-4, y que el 0,5% sufrió toxicidad letal6. Aunque capecitabina es un profármaco de 5-FU, existen diferencias significativas en cuanto a su perfil de toxicidad. Mientras que la toxicidad hematológica se asocia con más frecuencia a 5-FU, efectos adversos como diarrea, náuseas y vómitos, y síndrome mano-pie (SMP) están más asociados al tratamiento con capecitabina7. Esquemas quimioterápicos que contengan irinotecan pueden conducir a toxicidades graves, fundamentalmente mielosupresión y diarrea8. En cuanto al oxaliplatino, el efecto adverso más común es la neurotoxicidad, que puede perdurar en el tiempo después de la suspensión del fármaco9.

La farmacogenética estudia los factores genéticos que influyen en la variabilidad interindividual en la respuesta a medicamentos, tanto en la eficacia como en la toxicidad. En el caso de la farmacogenética en oncología se ha avanzado bastante en los últimos años y uno de los tumores con más resultados en esta área ha sido el CCR10,11. Varias son las asociaciones claramente establecidas en farmacogenética del CCR y reacciones adversas. Se ha demostrado que en pacientes tratados con irinotecan, la presencia del alelo *28 del gen de la uridina difosfato-glucuronosiltransferasa (UGT1A1 *28) aumenta 7 veces las probabilidades de tener diarrea y neutropenia grados 3-4, y esto se predice con un 86% de positi-vos12,13. Otra evidencia se refiere a la relación entre toxicidad grave al tratamiento con 5-FU en pacientes con variantes del gen de la dihidropirimidina dehidrogenasa (DPYD), fundamentalmente el alelo *2A14.

Nuestro grupo ha contribuido a este campo identificando varios polimorfismos genéticos asociados a determinadas reacciones adversas a la quimioterapia en pacientes con CCR15-17. Describimos cómo polimorfismos del gen ABCB1 se encontraban asociados a neutropenia moderada-grave (rs1128503) y a síndrome mano-pie (SMP) (rs1128503, rs2032582 y rs1045642) en pacientes de CCR tratados con regímenes de quimioterapia que contenían capecitabina, y a diarrea moderada-grave (rs1045642) en pacientes tratados con regímenes que contenían 5-FU15. Así, el hecho de ser homocigoto mutante o heterocigoto para estos tres polimorfismos de secuencia única (SNPs) en ABCB1 supuso una menor probabilidad de padecer neutropenia y SMP grado 2-5 en pacientes tratados con regímenes que contenían capecitabina en comparación con los homocigotos salvajes CC; por el contrario, estos últimos estuvieron expuestos a un menor riesgo de desarrollar diarrea grado 2-5 frente a esquemas basados en 5-FU15. Para limitar el efecto de las distintas combinaciones de tratamientos y estadios del tumor se realizó posteriormente un estudio que incluía pacientes con un tratamiento más homogéneo (FOLFOX/XELOX en adyuvancia) y en el que los SNPs rs11615 en ERCC1 y rs28399433 en CYP2A6 (gen que codifica para la proteína CYP2A6, involucrada en la conversión de tegafur a 5-FU) se asociaron de una forma estadísticamente significativa con el desarrollo de neutropenia17. La variante rs2297595 en DPYD se asoció al desarrollo de náuseas y vómitos grado 3-5 en esta misma población17.

El objetivo del presente estudio es validar estos posibles marcadores farmacogenéticos de toxicidad (rs1128503, rs2032592 y rs1045642 en ABCB1, rs11615 en ERCC1, rs28399433 en CYP2A6 y rs2297595 en DPYD) en una nueva cohorte de pacientes de CCR frente a tratamientos basados en 5-FU o capecitabina, y frente a los esquemas FOLFOX/XELOX en adyuvancia con el fin de que puedan ser utilizadas en un futuro cercano como medio para decidir la terapia más adecuada para cada paciente.

Para validar las asociaciones identificadas por nuestro grupo en dos trabajos previos entre efectos adversos a la quimioterapia y variaciones genéticas se reclutaron tres grupos de pacientes diagnosticados de cáncer colorrectal: 157 pacientes tratados con regímenes quimioterápicos que contenían capecitabina, 99 pacientes tratados con regímenes que contenían 5-FU y un tercer grupo de 83 pacientes tratados en adyuvancia con FOLFOX o XELOX. Las características basales de cada una de estas tres cohortes de validación fue comparada con las cohortes de exploración de los trabajos originales, que estaban formadas por 74, 67 y 47 pacientes para tratamiento basados en capecitabina, 5-FU y FOLFOX/XELOX, respectivamente. En líneas generales, las características basales de los pacientes incluidos en cada cohorte de validación fueron muy similares a las de la equivalente cohorte exploratoria (Tabla 2). Sin embargo, en los tres tratamientos analizados el tratamiento previo resultó estadísticamente significativo entre las cohortes de exploración y las de validación. Por otro lado, en los pacientes tratados con quimioterapia que contenía capecitabina la cohorte exploratoria tenía una edad al diagnóstico mayor que en la cohorte de validación (70 versus 66). Finalmente, también se encontraron diferencias en el grado de tumor en los pacientes tratados con esquemas que contenían 5-FU.

En los pacientes tratados con regímenes quimioterápicos que contenían 5-FU no se observó una asociación estadísticamente significativa entre el polimorfismo rs1045642 en ABCB1 y diarrea grados 2-5 (p = 0,612). Los pacientes homocigotos TT para este polimorfismo, al igual que lo obtenido en la cohorte exploratoria, presentaron mayor probabilidad de desarrollar diarrea moderada-grave (42,9%) que el resto de genotipos (30% CT y 33,3% CC), pero no se mantuvo la gradación que se observó en la primera cohorte y que apuntaba a un efecto del alelo variante T para este polimorfismo en el incremento del riesgo de diarrea (Tabla 3).

Tampoco se mantuvo estadísticamente significativa en la cohorte de validación ninguna de las asociaciones obtenidas previamente entre los tres polimorfismos en el gen ABCB1 y efectos adversos al tratamiento basado en capecitabina (Tabla 4). En la cohorte exploratoria el alelo T para los polimorfismos rs1128503, rs2032592 y rs1045642 en ABCB1 resultó ser un marcador de baja probabilidad de desarrollar neutropenia y SMP moderado-grave. Sin embargo, estos hallazgos no pudieron ser confirmados en la nueva cohorte de pacientes. No se obtuvo ninguna asociación en el desarrollo de SMP moderado-grave frente a esquemas basados en capecitabina y los polimorfismos ABCB1 rs1 128503 (p = 0,887), rs2032592 (p = 0,888), o rs1045642 (p = 0,252), ni de neutropenia moderada-grave y el polimorfismo ABCB1 rs1128503 (p = 0,434) (Tabla 4).

En cuanto a las asociaciones entre reacciones adversas graves al tratamiento adyuvante FOLFOX o XELOX y los SNPs rs2297595 en DPYD, rs11615 en ERCC1 y rs28399433 en CYP2A6 tampoco se obtuvieron asociaciones estadísticamente significativas (Tabla 5). La asociación obtenida previamente entre rs2297595 DPYDy náuseas y vómitos (p = 0,054) no se confirmó en la nueva cohorte independiente (p = 0,850). Coincidiendo con los resultados obtenidos previamente, los pacientes homocigotos para la variante T del polimorfismo rs11615 en ERCC1 presentaron menor probabilidad de desarrollar neutropenia grave (5,6%) que los pacientes con los genotipos CT y CC (11,8 y 7,7%, respectivamente), aunque la asociación no fue estadísticamente significativa (p = 0,786). En cuanto al polimorfismo rs28399433 en CYP2A6, fueron los pacientes heterocigotos GT aquéllos que presentaron un mayor riesgo de neutropenia grave a lo largo del tratamiento en ambas cohortes de pacientes, pero la asociación no se mantuvo estadísticamente significativa en la cohorte de validación (p = 0,622).

La identificación de biomarcadores predictivos de toxicidad a los regímenes quimioterápicos utilizados en el tratamiento del CCR podría ayudar a seleccionar la mejor opción terapéutica para cada paciente y así minimizar la aparición de reacciones adversas graves a la quimioterapia en estos pacientes10. Sin embargo, a pesar de que hay una gran variedad de artículos que muestran asociaciones entre variantes génicas y reacciones adversas a la quimioterapia en CCR, éstas a menudo no se replican en otros estudios, lo cual dificulta la aplicación clínica de la farmacogenética18. En trabajos anteriores, encontramos varios polimorfismos asociados de una manera estadísticamente significativa a determinadas reacciones adversas a la quimioterapia en pacientes con CCR del Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid). Por lo anteriormente comentado, el objetivo del trabajo fue validar los resultados obtenidos en una nueva cohorte de pacientes, esta vez mayoritariamente atendidos en un hospital diferente (Hospital Universitario Doce de Octubre, Madrid) antes de estudiar su aplicación clínica. En nuestros trabajos iniciales se describieron por primera vez, asociaciones de polimorfismos en genes como ABCB1 y efectos adversos a 5-fluorouracilo y capecitabina15. Otros polimorfismos, como el rs28399433 en el gen CYP2A6, eran relacionados por primera vez con un efecto adverso concreto, en este caso neutropenia17, aunque previamente había sido descrita la relación de este polimorfismo con la transformación de tegafur a 5-FU19.

Los resultados, sin embargo, no han podido ser más desalentadores, ya que ninguna de las siete asociaciones estudiadas pudo ser confirmada. Probablemente, la razón fundamental de esta falta de replicación es el bajo número de pacientes incluidos en los estudios exploratorios, limitación apuntada ya en los trabajos originales15,17. Dada la naturaleza de las variables principales que determinan el tamaño muestral (porcentaje de pacientes con el efecto adverso y frecuencia del alelo menos frecuente), éste está a menudo infraestimado en los trabajos de farmacogenética, como claramente ocurre en nuestros trabajos originales. Aunque este dato es muy variable se ha estimado que el número de casos requeridos para analizar un único polimorfismo requiere una n de 496 (para odds ratio > 2, 5% de menor frecuencia alélica en un estudio caso-control bajo la asunción de un 5% de prevalencia del caso y con un completo desequilibrio de ligamiento, permitiendo un 5% de error α), mientras que si se analizan 500.000 SNP el tamaño muestral asciende hasta 1.20620.

Además, el caso del tratamiento en CCR es especialmente complicado ya que la mayoría de tratamientos no son monoterapia sino que se administra una combinación de varios fármacos4. Esto unido a disminuciones y retrasos de dosis a menudo sin un criterio fijo (criterio médico, reacciones adversas, petición del paciente…) son factores que podría estar alterando los resultados. El estudio de pacientes en tratamiento adyuvante perseguía disminuir esta variabilidad, pero aún así los resultados no han podido validar las observaciones originales, lo que demuestra las limitaciones de este tipo de estudios.

Si además tenemos en cuenta que en los estudios de asociación en farmacogenética no estudiamos un único SNP sino un número muy variable de ellos la aplicación de correcciones estadísticas mediante análisis multivariantes se hace imprescindible, aunque a menudo no se realizan en estudios farmacogenéticos21. En nuestro caso, las 3 asociaciones (rs11615 en ERCC1 y neutropenia, rs28399433 en CYP2A6 y neutropenia, y rs2297595 en DPYD y nauseas/vómitos) analizadas en la cohorte de exploración de pacientes en tratamiento adyuvante presentaron una significación estadística en un análisis multivariante17, corrigiendo, al igual que otros autores, por sexo y PS22,23. A pesar de esto, ninguna de estas asociaciones fue replicada en la cohorte de validación, demostrando el importante peso en los resultados finales de todos los factores de variabilidad mencionados anteriormente: tratamiento, tamaño muestral, dosis, etc.

Las distintas cohortes de exploración y validación utilizadas han reflejado características basales diferentes de manera estadísticamente significativas. Esto hace que los resultados tengan que ser tomados con cautela, principalmente el dato del grupo tratado con capecitabina donde la mediana de edad en la cohorte de validación fue cuatro años menor que la de la cohorte de exploración. Sin embargo, dado que lo que analizamos tiene que ver con la toxicidad al tratamiento, tanto el grado del tumor como el tratamiento previo que recibió el paciente son características que podrían afectar mucho a la respuesta al fármaco, pero no a las reacciones adversas. Estas variaciones pueden ser debidas a las distintas formas de prescribir tratamientos que se dan entre hospitales, ya que las cohortes de exploración están compuestas exclusivamente por pacientes del Hospital General Universitario Gregorio Marañón y las de validación lo están principalmente por pacientes del Hospital Universitario Doce de Octubre. El estudio, por lo tanto asumía que estas diferencias se podían dar y que si las asociaciones se validaban el resultado era más robusto. Y esto no ha sido así.

Muy recientemente se ha demostrado la complejidad de llevar a cabo estudios retrospectivos de biomarcadores, de tal manera que se puede perder una asociación si la población de estudio es heterogénea, tal y como ocurre en el caso de CYP2D6 y tamoxifeno en cáncer de mama24. Nuestro estudio fue prospectivo/retrospectivo, por lo que se añade otro factor de variabilidad en los resultados.

Todo ello demuestra que el camino hacia la aplicación de determinaciones farmacogenéticas en general, y en CCR en particular, pasa ineludiblemente por la validación de estas pruebas con grandes tamaños muestrales debido a las múltiples variables que normalmente se analizan y reducen el tamaño muestral de cada subgrupo, con tratamientos y estadios de enfermedad lo más uniformes posibles y preferentemente con estudios prospectivos.

En conclusión, ninguna de las asociaciones entre variaciones genéticas (rs1128503, rs2032592 y rs1045642 en

ABCB1, rs11615 en ERCC1, rs28399433 en CYP2A6 y rs2297595 en DPYD) y reacciones adversas a la quimioterapia en pacientes de CCR obtenidas previamente por nuestro grupo fue confirmada en una nueva cohorte de pacientes, mayoritariamente tratados en otro hospital. Pese a ello, sería necesario analizar estas asociaciones en una cohorte más amplia de pacientes, todos ellos con el mismo tratamiento y dosis perfectamente establecidas, antes de desechar su posible utilidad en la predicción de toxicidad a regímenes quimioterápicos a nivel clínico.

El trabajo ha sido financiado por la Fundación Española de Farmacia Hospitalaria (Beca Ruiz-Jarabo 2012) y por el Instituto de Salud Carlos III (PI12/00056).